TEKNIK IDENTIFIKASI BAKTERI

PENDAHULUAN

Ralstonia solanacearum E.F Smith merupakan penyebab penyakit layu bakteri yang sering menjadi faktor pembatas produksi tanaman, antara lain tomat, kentang,kacang tanah, tembakau, pisang dan terong juga tanaman lain seperti tanaman hias dan bermacam-macam kelompok gulma.
Bakteri yang berasal dari devisi Gracilicutes, kelas Proteo-bacteria, ordo Eubacteriales, famili Pseudomonadaceae, dan genus Pseudomanas ini, mempunyai sinonim Bacillus solanacearum E.F Smith, Bacterium solanacerum Chester, Bacillus nicotianae Uyeda, Bacillus musae Rorer, Bacillus musarum Zeman, phytomonas solanacearum (E.F Smith) Bergey et .al.,Erwinia nicotianae (Uyeda) Bergey et.al., Xanthomanas solanacearum (E.F Smith awsn, Bulkholgaria solanacearm dan Pseudomonas solanacearum.
Sifat morfologi bakteri ini : berukuran 0,5 – 0,7 x 1,5 – 2,5 mikron, berbentuk batang dengan ujung membualat, tidak membentuk kapsul, tanpa spora, motil dengan satu flagela polar, isolat yang virulen umumnya flagelnya pendek dan pergerakan lambat, sedang yang avirulen flagelnya lebih panjang dan memungkinkan bergerak lebih cepat. Sel bakteri mengandung poli-beta hidrosibutiratberwarna biru/hitam bila diberi zat warna sudan hitam, tidak membentuk pigmen fluorecent,gram negatif, bersifat aerobik dan oksidatif, mereduksi nitrat, beberapa strain dapat menghasilkan gas nitrat, mampu menghidrolisa gelatin dan tween 80, tidak menghasilkan asam dari sukrosa, tidak dapat tumbuh pada suhu <> 410C dan jumlah guanin dan sitosin dalam DNA 66-69%. Pada media padat kolni berbentuk kecil dengan ukuran 3-5 mm, tidak teratur, ramping dan licin. Bila diinokulasikan pada media agar ( suhu 28OC) koloni akan muncul dalam waktu 36-48 jam, dan bila diinokulasikan pada suhu yang lebih rendah koloni nampak dalam waktu 3-4 hari. Suhu optimum untuk pertumbuahn bakteri pada media adalah 270C-370C dan suhu minimum 15oC . Suhu optimum untuk perkembangan patogen ini dialam berkisar 280C-320C.
Pada media Triphenil tetrazolium Chlorida (TTC) koloni bakteri tampak dengan ciri bulat berukuran 3-5 mm dan berlendir dengan endapan formasan berwarna merah muda bagian tenagh dan bagian tepi berwarna putih, sedang pada media NGA koloni nampak warna putih kecoklatan, bulat dan berlendir. Koloni yang virulen berwarna merah terang, sedang yang virulen merah tua. Bakteri patogen tidak banyak bergerak sedangkan yang non-patogen pergerakannya aktif.

IDENTIFIKASI BAKTERI RALSTONIA SOLACEARUM

Identifikasi bakteri R. salanacearum dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu dengan melihat sifat morfologinya, misalnya ukuran dan bentuk sel,, warna dan bentuk koloni, adanya flagella, apakah membentuk spora. Hal inii dapat kita lihat dibawah mikroskop. Tetapi cara ini belum bisa memastikan apakah yang kita lihat tersebut adalah R. solanacearum, karena sifatnya yang mirip dengan genus Ralstonia lainnya atau bakteri lain yang mempunyai morfologi yang hampir sama (Xanthomaonas campestris misalnya). Sehingga perlu dilakukan pengujian sifat fisiologi dari bakteri. Pengujian yang dapat dilakukan diantaranya adalah : reaksi gram, pewarnaan gram, poly B hidroksibutirat (PHB), Oksidase–fermetasi test, arginine dihidrolisa,, denitrifikasi, reduksi nitrat, pembentukan indol, asam, H2S, asetil metill karboksil, pengujian kemampuan menggunakan berbagai sumber karbon, ujii gelatin hidrolisa, pengujian enzim, toxin dan senyawa kimia lain yang dihasilkan, penentuan komposisi guanin (G) dan sitosin (C) dalam DNA, kepekaan terhadap antibiotika, dan uji virulensi.

UJI GRAM, Pemeriksaan ini dilakukan dengan menggunakan KOH 3%, untuk mengetahui sifat bakteri apakah gram positif atau negatif. Sebanyak satu atau dua tetes larutan suspensi bakteri diteteskan pada gelas objek. Kemudian inokulum bakteri yang berumur 24 jam dengan menggunakan jarum oose diletakkan pada tetesan larutan KOH 3% tersebut. Inokulum diaduk selama 5-10 detik dan kemudian jarum ose diangkat keatas dari tetesan tadi. Bila larutan KOH menjadi kental ( viscous) dan cairan mengikuti jarum oose sampai 0,5-2 cm, saat jatum oose diangkat , hal ini menunjukkan bakteri yang diperiksa adalah gram negatif. R. solanacearum bereaksi positif dengan berlendir dan melekat sehingga termasuk gram negatif.

PEWARNAAN GRAM.
Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif, R. solanacearum menunjukkan warna merah pada olesan ( gram negatif ).

UJI OKSIDASI-FERMENTATIF.
Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri bersifat oksidif atau fermentatif. Dua tabung reaksi , masing-masing diisi 4,5 ml larutan glukosa 10% sebanyak 0,5 ml yang telah distrerilkan, kemudian diinokulasi dengan biakan murni bakteri . Salah satu tabung ditutup dengan vaselin steril sedalam 2 cm, dan tabung yang lain tanpa ditutup. Diinkubasikan selama 7-14 hari, organisme oksidatif terjadi jia terlihat perubahan warna pada tabun reaksi yang terbuka, sedangkan organisme fermentatif dapat diindikasikan dengan melihat tidak adanya perubahan warna pada tabung reaksi tertutup. R. Solanacearum merupakan organisme oksidatif.

UJI OKSIDASE KOVAC’S.
Koloni bakteri dengan menggunakan jarum oose dioleskan pada kertas saring yang telah dibasahi dengan larutan tetramethyl paraphenylene diamine dihidrochiororde 1% dan diaduk secara melingkar, reaksi negatif terjadi jika tidak ada perubahan warna, reaksi positif diunjukkan apabila terjadi perubahan warna pada koloni dari putih menjadi berwarna ungu. R. solanacearum menunjukkan reaksi positif.

UJI HIDROLISA PATI.
Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah menghidrolisis dan memanfaatkan zat pati sebagai sumber energi. Inokulum digoreskan pada media hidrolisispati dan diinkubasi selama 1-7 hari pada suhu kamar. Kemudian seluruh permukaaan agar digenamgi dengan larutan iodium. Reaksi positif ditandai dengan tampaknya area jernih disekitar koloni, sedangkan reaksi negatif apabila disekitar koloni berwarna biru gelap.

UJI PRODUKSI ARGININ DIHIDROLASE.
Dua tabung reaksi yang diisi larutan medium (warna ungu) disterilisasi pada suhu 1210C selama 10 menit. Inokulasi suspensi bakteri dengan jarum oose dan tutup tabung dengan menggunakan agar dingin 3 % yang telah disterilkan. Adanya perubahan dari warna ungu ke warna merah setelah diinkubasi 7-14 hari menandakan reaksi positif.

UJI DENGAN MEDIUM TTC.
Uji ini bertujuan untuk membedakan tipe kolonii bakteri R. solanacearum dengan bakteri lainnya. Isolat murni bakteri ditumbuhkan pada media TTC dengan pengoresan. Inkubasi 2-3 hari lalu amatii koloni yang muncul. Bentuk koloni terlihat adanya reduksi TTC menjadi formasan yang berwarna merah dibagian tengah koloni, menandakan itu adalah R. Solanacearum.

MEDIA KING’S B.
Pengujian ini digunakan untuk membedakan apakah bakteri menghasilkan flourecesn atau tidak. Bakteri yang mampu menghasilkan flourecens memperlihatkan warna hijau muda menyala disekitar koloni dan dibawah sinar ultra violet, fluorecens ini akan tampak nyata. R. solanacearum tidak mampu membentuk fluorecens.

UJI REAKSI HIPERSENTITIF.
Uji hipersentitif menggunakan daun tembakau yang telah dewasa yang diinjeksi suspensi bakteri 10 8 Cfu/ml pada bagian epidermis dan pengamatan dilakukan sejak 24 jam pertama hingga 96 jam setelah inokulasi. Daun tembakau yang diinjeksi dengan bakteri patogen akan menunjukkan reaksi hipersentitif yaitu terjadinya nekrosis pada jaringan epidermis daun tersebut.
Untuk membedakan species-species R. solanacearum dengan species Pseudomanas lainnya ( khususnya species non-fluorescent), dengan membandingkan hasil data pengujian pada tabel pembanding species seperti dibawah ini :

Pengujian Species Ralstonia
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Jumlah flagel polar 1 1-2 >1 >1 >1 >1 1-2 >1 >1
Oksidase Kavac’s - + + + + + + + +
Arginine dihidrolisa - - + - - - - - -
Reduksi Nitrat - + - d + d + + +
Denitrifikasi - - + - - - - - d
Hidrolisis Tween 80 - + d + - + + - +
Hidrolisa Gelatin - d d d + + + - +
Hidrolisa Starch/amilum - + - - - - - - -
Asam dari Sukrosa - - + d + + - - +
Pigmen difusible - - g,y d g,y g,y - - b
Pigmen non difusible - - - g,y - - - - -
Keterangan : (1) P. andropogonis (2) P. avenae (3) P. Caryophyly
(4) P. Cepacia (5) P.corrugata (6) P. gladioli
(7) P.rubrilineans (8) P. rubrisubalbicans
(9) R. solanacearum
- = reaksi negative + = > 90 positif d = 11-89% positif
g = hijau y = kuning b = brown

IDENTIFIKASI BIOFAR

Pengelompokan bakteri R. solanacearum dibawah species (sub species) yang didasarkan pada perbedaaan reaksi kimia. Biasanya dilakukan dengan melakukan test produksi asam dari berbagai jenis gula. Tujuannya adalah untuk mengetahui kemampuan R..solanacearum dalam menggunakan gula sebagai sumber carbon. Senyawa gula yang dimaksud adalah maltosa, laktosa, sellobiosa, mannitol, sorbitol, dan dulcitol. Masing-masing gula tersebut distrerilisasi dalam bentuk larutan dengan konsentrasi 0,3% w/v. Selanjutnya secara terpisah ditambahkan kedalam media mineral dasar pada tabung reaksi yang telah disterilkan. Koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum oose kemudian ditenggelamkan kedalam tabung reaksi tersebut, perlakuan ini di inkubasikan pada suhu 290C dan dilakukan pengamatan terjadinya perubahan warna pada tabung hingga hari ke-21. Dari hasil pengujian ini akan diketahui apakah R. solanacearum yang diisolasi tergolong dalam biovar-biovar yang telah diketahui. Hasil untuk biovar R. solanacearum terlihat pada tabel berikut :
Senyawa gula B i o v a r
I II III IV V
Maltosa - + + - +
Laktosa - + + - +
Sellobiosa - + + - +
Mannitol - - + + +
Sorbitol - - + + -
Dulcitol - + + + -

IDENTIFIKASI RAS DAN STRAIN

Perbedaan bakteri dibawah species yang didasarkan pada varietas/galur tertentu yang diserang dan berdasarkan kemampuannya menggunakan gula alkohol ( mannitol dan dulcinol ) serta gula ( laktosa dan maltosa ). Banyaknya ras dan strain membedakan pula patogenisitas dan sifat biokimianya. Dewasa ini telah diketahui ada 5 ras R. solanacearum yang berbeda tanaman inangnya, yatu : ras 1 yang menyerang tanaman solanacea seperti tomat, kentang, kacang tanah, cabai, tembakau . Ras 2 menyerang pisang-pisangan ( musaceae ) dan heliconia. Ras 3 terbatas untuk tanaman kentang pada dataran tinggi. Ras 4 strain jahe-jahean ( gingger ) dan ras 5 menyerang khusus tanaman murbei ( mulberry ).

TEKNIK IDENTIFIKASI MODERN

Selaras dengan kemajuan teknologi, teknik identifikasi bakteri turut berkembang pula, apabila sistem konvensional diras mempunyai beberapa kekurangan seperti ; memerlukan waktu yang lama untuk diketahui hasilnya karena sifat bakteri yang lambat tumbuh, dirasa masih kurang akurat karena memerlukan beberapa kali percobaan (pengalaman), dan membutuhkan teknisi yang terampil serta tenaga kerja yang lebih banyak.
Teknik diagnosa yang berkembang dengan sistem moderen telah dilakukan ilmuwan-ilmuwan dalam bidang fitopatologi maupun kedokteran. Teknik ini ternyata tidak hanya dapat dilakukan untuk menidentifikasi bakteri tetapi patogen lain seperti cendawan dan virus pun dapat dideteksi jenisnya. Kekurangan teknik dignosa modern sekarang ini adalah soal biaya yang dibutuhkan untuk melakukan serangkaian pengujian. Contoh beberapa teknik diagnosa modern yang sekarang berkembang adalah :
1. Nutritional Kits (BIOLOG)
2. Profil Asam Lemak menggunakan Gas chromatografi
3. Profil Protein: SDS-PAGE dengan menggunakan elektroforesis
4. Test serologi: Aglutinasi, ELISA, IF. Immunobloting
5. Test molekuler : RFLP, PCR
SISTEM IDENTIFIKASI BIOLOGI

Merupakan sistem yang didasarkan pada pola reaksi metaboliknya (kemampuan) memanfaaatkan 95 jenis sumber karbon (C) yang teersediapada sebuah plat mikro (micro plate), seperti glikogen, maltose, galactose,glyserol. Dimana isolat murni bakteri yang telah ditumbuhkan dimasukkan kedalam gelas beaker yang telah berisi larutan NaCL 0,85%. Suspensi yang terbentuk dimasukkan kedalam tabung spektrofotometer 108 CFU/ml untuk mengukur kepadatan populasinya. Lalu pipet masing-masing 150 ml supensi dan masukkan kedalam lubang mikro plat. Inkubasi pada suhu 300C selama 4-24 jam lalu dimati dengan me entry data ke komputer (MIKROLOG). Reaksi positif jika blok/lubang mikroplat menunjukkan warna violet, sedangkan negatif jika tidak berwarna. Hasilnya dapat berupa exellent, good, poor, atau no id. Yang menunjukkan persen keakratan identifikasi.

PUSTAKA

Muh. Danial Rahim.1997. Pathophysiological Study Xanthomonas campestris
pv. Maivacearum Penyebab Penyakit Bercak Daun Bersudut Pada Tanaman Kapas Pasca Sarjana Sistem-Sistem Pertanian UNHAS.
Ujung Pandang.

Schaad, N.W., Jones, J.B., Chun, W.. 2001. Plant Pathogenic Bacteria. Third Edition. APS Press. USA

Susanto. 1996. Uji Patogenitas dan Fisiologi Bakteri Pseudomanas solanacearum E.F.Smith Yang Diisolasi Dari Rimpang Jahe. Fapertahut
UNHAS. Ujung Pandang

Z. Klement, dkk.1990. Methods In Phytobacteriology. Akademi Kiado,
Budapest.